新型基因编辑平台无需切断双链即可插入大片段DNA

研究人员发布了一种基因组编辑平台，该平台能够在不切断DNA双链的情况下，将大片段DNA序列插入人类T细胞，从而消除了长期以来阻碍开发更安全、非病毒方式制造工程化细胞疗法的技术瓶颈。这一平台名为PRIME-In，全称为“引导编辑介导的大片段整合”（Prime Editing-Mediated Large Integration），相关研究于4月30日发表在《自然·生物医学工程》上。

工作原理

与依赖双链DNA断裂来触发细胞修复机制的传统方法不同，PRIME-In利用先导编辑器仅对目标DNA的单链进行切刻，同时通过逆转录将一段短微同源序列引入供体质粒。该引导序列与基因组切刻位点发生杂交，并招募细胞自身的DNA聚合酶直接从供体延伸，从而绕过了对双链断裂、重组酶或两步式着陆垫插入的依赖。LinkedIn

升级版PRIME-In 2.0通过引入额外的向导RNA实现第二个基因组切刻位点，在HEK293T细胞中可达到高达88%的基因敲入效率，并能以超过80%的效率处理多达9.2千碱基的大载荷。在原代人T细胞中——这历来是非病毒基因编辑最具挑战性的靶标之一——该平台对3千碱基的CD19 CAR构建体实现了约50%的整合效率，并在短短七天内实现了11倍的T细胞扩增。LinkedIn

安全性概况

安全数据使 PRIME-In 区别于现有方法。染色体易位发生率仅为 0.2% 至 0.4%，而同源介导末端连接（一种常用替代方案）的发生率为 2.34%。脱靶敲入事件在全基因组范围内低于 4%，而同一对照方法的脱靶率为 23%。在小鼠异种移植模型中，PRIME-In 工程化 CAR T 细胞清除 Raji 肿瘤的效果与目前临床标准——慢病毒载体所产生的效果相当。

对细胞疗法的影响

该平台解决了阻碍CAR T细胞制造从病毒载体向非病毒方式转变的多个关键瓶颈。病毒载体存在插入性突变风险，且大规模生产成本高昂。依赖双链断裂的方法会引发细胞毒性和染色体异常，增加了监管审批的难度。PRIME-In在保持治疗级效率的同时消除了上述隐患，有望成为临床转化的有力候选方案。

这项研究的问世，恰逢碱基prime编辑技术在更广泛领域取得快速进展之际。今年早些时候，首批prime编辑疗法的临床结果显示，该技术在两名慢性肉芽肿病患者中安全地纠正了致病基因突变。与此同时，研究人员于4月29日在《自然》杂志上报道了一种相关的“prime组装”方法，可插入长达11,000个碱基对的DNA片段，进一步拓展了prime编辑疗法的应用前景。